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股票代码为（300404）建设于2002年，2015年在深圳创业板上市，是一家为海内外医药企业提供药品、保健品、医疗器械研发与生产全流程“一站式”外包服务(CRO)的型高新手艺企业，同也提供药品上市允许持有人(MAH)服务。
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药品研发“一站式”服务包括：新药立项研究和活性筛选、药学研究(含中试生产)、药理毒理研究、临床用药与模拟剂的生产、临床试验、临床数据管理和统计剖析、上市后再评价、技
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公司新闻
袁来云云 | 大分子生物剖析概论（十四_上）：LBA定量剖析双特异性生物药的挑战
作者：广州333体育官网医药 时间：2021-08-18 泉源：广州333体育官网医药
     本文为系列文章《大分子生物剖析概论》的第十四篇，旨在凭证已揭晓的文献资料，起源的先容定量剖析双特异性抗体的LBA要领所面临的挑战。
 
     由于内容篇幅较长，本文将接纳上下篇形式举行推送，敬请垂注！《袁来云云》专栏系广州333体育官网医药微信公众号打造的科普学术专栏，内容均为333体育官网医药药物研究中心资深科学照料袁智博士原创。

 
     与古板（单特异性）的生物药相比，双特异性生物药对其药代动力学（PK）的表征提出了奇异的挑战。在此配景下，开爆发物药的生物剖析战略正在迅速演变，以支持这些一直转变的药物模式。


     一样平常说来，生物剖析战略应凭证药物的作用机制（mechanism of action，MOA）和开发阶段定制。关于 mAb 药物，用于剖析药代/毒代动力学（PK/TK），药效动力学和免疫原性的剖析要领通常划分为定量剖析、“游离”和“总”药物浓度、“游离”和“总”靶标浓度、抗药物抗体（ADAs）和中和性 ADAs的开发和验证。关于具有重大结构的抗体衍生物（antibody derivatives），衍生物的每个功效域可能需要特另外一组检测要领，从而可能导致测试要领的数目几何级增添。


     别的，与开发默认没有生物转化（biotransformation）的mAb相比，重大的抗体衍生物更容易爆发生物转化，这意味着可能需要另一组测试要领来形貌重大抗体药物的结构完整性及其生物转化后的州产品（biotransformed variants）。


     配体团结式测试要领（LBA）是mAbs生物剖析的主力军，同时液相色谱-质谱要领（LC-MS）也在近年越来越受欢迎。这两种剖析手艺也主要应用于抗体药物及其衍生物的生物剖析。

 
     由于药物模式的重大性，通常需要多个 LBA/LC-MS 剖析要领。当每个剖析要领都有特定的取样程序，并且并非所有的检测可以在一个生物剖析实验室实验时，奇异的样本收罗、处置惩罚、贮存、运输和剖析条件，会造成重大的后勤需求。因此，需要设计一种生物剖析战略，用于表征双特异性分子的PK特征，并研究其体内结构-功效关系。本文提供了若干相关案例研究和羁系层面的展望。

导论

    近年来，卵白质工程和生产方面的希望推动着生物制药行业开发越来越重大的卵白质药物，其能够团结多个药物治疗靶标，故能够提高疗效和/或者镌汰剂量，用以降低毒性，使清静危害最小化，提高用药的利便性和依从性等。双特异性药物被界说为基于抗体（antibody-based）或基于框架（scaffold-based）的卵白质药物，其包括一个以上的工程刷新功效区域，该功效区域团结两个或多个自力的抗原靶点。本文集中关注双特异性药物的两个奇异的功效域，其团结与疾病的爆发和希望相关的卵白质，而不思量抗体骨（主）干（antibody backbone）的功效。


    开发双特异性生物药的领域，基于并生长了古板的单分子靶点的抗体免疫疗法的框架，正在蓬勃生长，以靶向协同的分子途径（target synergistic molecular pathways）来更有用地治疗疾病。两种双特异性抗体，blinatumomab（Blincyto）和catumaxomab（Removab）已经在美国或欧盟批准上市，用于肿瘤顺应症的治疗；这证实晰这类药物分子的应用价值。现在有60多种用于癌症和其它疾病的新型双特异性生物药正在临床开发之中。


双特异性生物药分子


     双特异性分子可以以州差别的结构泛起，使用抗体可用的种种团结域。这些团结域包括可变重链(VH)、可变轻链(VL)、单链分子(ScFv)和/或抗体的Fc域，可以组合使用这些结构域，以团结多个分子靶标。具有多个Fab团结域的双可变域免疫球卵白(dual-variable domain immunoglobulin，DVD -Ig)这样的大型免疫球卵白分子和较小的串联ScFv结构域(diabody)，在分子巨细和结构上代表了两个极端，它们都可通过种种卵白质工程手艺生产出来(图1)。

    图1. 双特异性分子的结构。本图展示了三个双特异性抗体的例子：1. Hetero-lg；2.双可变结构域/dual variable domain；3.antibody-peptibody；这些代表了差别的分子巨细，结构及重大性。

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      现在的手艺允许卵白质团结域（protein binding domains）和抗体支架（antibody scaffolding）的多种组合，形成一系列奇异的药物模式（drug modalities）。双特异性药物的几个功效种别包括：与可溶性靶标团结以抑制或刺激相关功效、与细胞靶标团结以拮抗或刺激相关功效、与细胞靶标团结以招募免疫细胞以增进抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)功效。


     对双特异性分子奇异的结构和作用机制(MOA)给药代动力学和药理学(PK/PD)评估，体内结构-功效关系简直定以及临床前和临床药物开发阶段所需的生物剖析支持带来了新的挑战。


双特异性抗体

     双特异性抗体是通过基因工程重组生产的抗体，由两个差别的团结域（two distinct binding domains）组成，能够团结两种差别的抗原或统一抗原的两个差别表位。它们可以分为两个主要种别，即带有或缺少Fc区域的两类。关于生物剖析支持， FDA关于双特异性抗体开发的指南指出：可能需要开发多种PK定量要领，以定量总（total），团结（bound）和未团结（unbound）的双特异性抗体的浓度；也可能需要多个免疫原性测试要领，来测试对双特异性抗体差别结构域的免疫反应。

 
 
     由于双特异的性子，双特异性抗体的未团结或“游离”PK定量要领可以包括三个测定要领：一个双功效要领同时测定两个活性团结域（active binding domains）和两个单功效要领划分测定二个团结域中之一。双功效要领划分使用两个靶标卵白作为捕获和检测试剂。单功效要领使用一个靶标卵白作为捕获试剂，而使用抗人类IgG作为检测试剂。通常，在诠释检测效果时应审慎，由于单特异性要领缺乏特异性，故也能检测到双功效分子。


     双特异性抗体的定量PK剖析要领面临生物转化（biotransformation）的重大挑战，因此，通常定制开发要领以定量某个功效域生物转化的水平。奇异的双特异性结构可能造成意外的生物转化路径，并可能使PK行为重大化。


双特异性生物药的PK/PD


    双特异性分子增添了PK建模的重大性，例如，表征靶向介导的药物处置惩罚需要思量两个靶点的表达，它们以差别的频率泛起在差别的细胞类型上。“游离”药物浓度与“总”药物浓度的定量，关于PK/PD建模至关主要，特殊是当涉及可溶性靶点时；可是，由于靶标卵白在体内的差别表达模式（expression patterns），药物定量剖析可能会变得越发重大。在绝大大都的临床研究中，药物浓度是在所谓的“中央隔室central compartment”或系统循环（systemic circulation）中，以血浆或血清样本的形式，测定的，这在很洪流平上是由于易于从服用药物的受试者中取样。凭证几十年累积的科学数据，系统药物浓度（systemic drug concentrations）反应了药物在靶标作用部位的浓度。血液病是一个破例，但纵然是血液病也通常含有固体组织的部分。系统药物浓度和作用所在（site-of-action）的药物浓度之间的关系会因作用所在的差别而差别，但适当的动物模子数据通常为人体状态提供了可靠的模子。

 
     由于药理学或药效学响应依赖于全身药物浓度，准确明确PK-PD关系关于展望抵达预期响应的剂量和袒露量极为有用。同样主要的是，确定可能爆发在每个奇异的双特异性分子上的任何潜在的体内生物转化（in vivo biotransformation），并彻底表征差别的药物在袒露量和活性方面的差别。总体来说，这些表征有助于明确药物的袒露量-响应关系，并提供了，基于药物变构体活性，优化剂量设计计划。


    PK评估是非临床毒理学研究和临床开发的一定需求，在非临床疾病模子评估中也施展着主要作用；一样平常在非临床疾病模子评估中，研究药物剂量-响应的特征，用以选择先导药物。非临床毒理学研究中的全身袒露量数据，可用于确定首次对人(FIH)研究的清静起始剂量，该起始剂量是基于此类清静研究确定的袒露量余量（exposure margin）。袒露量余量由未视察到不良反应水平(NOAEL)的动物袒露量与选定人体剂量的预期袒露量的比值确定，通常设定为比NOAEL预期的人体等效剂量(HED)低10倍。由于双特异性分子可靶向多种心理或病理途径，因而可能具有更强的药理和/或毒理学作用；故羁系机构可能要求制药商使用“最低预期生物效应水平”（MABEL）模子来选择FIH剂量,这意味着需要比基于NOAEL更低的起始剂量。临床研究中较低的起始剂量，意味着可能需要提高PK要领的迅速度；思量到双特异性分子的重大性，这可能是一个挑战。

 
PK定量剖析要领

 
    为了支持切合药物预期用途的PK数据的可靠性和有用性，羁系机构希望制药商，对所有的GLP研究/要害临床试验，使用经由验证的剖析要领来定量药物浓度。羁系部分为生物剖析要领的验证提供了详细的指南，这些指南在全球各羁系机构中普遍一致。这些指南文件清晰地剖析了对剖析要领参数的性能及其可接受值的羁系期望，包括网络，贮存和剖析历程中研究样本的完整性。关于检测试剂的讨论，特殊是捕获和检测试剂的选择，剖析名堂和手艺平台，以及用于PK表征和PK/PD相关性剖析的相关待测物，都可以在科学文献中找到。关于靶标在血液循环中的药物（这些靶标可在血清或血浆样本中形成药物-靶标复合物），关于应当测定的最相关的药物形式(不包括生物转化物/ biotransformants)仍然保存争议:“总体”(团结了 + 未团结靶标的药物)或“游离部分”或“活性部分”(未团结靶标的部分)。关于总药物浓度和游离药物浓度的问题最好凭证靶标的已知状态，药物的MOA和特征，项目团队的意见，手艺可行性，以及羁系反�。ㄈ羰切枰幕埃�，按个案处置惩罚的原则解决。最近有文献讨论了相关问题。


LBA定量要领


   生物剖析战略的选择可以凭证药物特定的开发阶段而有所差别。例如,在非临床物种中研究人类卵白药物, 使用不与非人类物种交织反应的，针对人类卵白的试剂，特殊是非人灵长类同源物，例如,重组人源化单克隆抗体（recombinant humanized monoclonal antibody，rhuMabs）,可以开发一种通用的，快速且经济的PK剖析要领来测定总药物浓度，以支持周全的毒理学评价。然而,这种要领不可用在临床研究中,越发药物特异性试剂，例如，靶标抗体和anti-idiotypic抗体，更可能是须要的：使用通用试剂与内源性分子爆发交织反应会滋扰卵白药物浓度的定量，而测定游离药物的浓度与建设PK-PD关系息息相关。非临床和临床生物剖析战略的另一个问题是，使用针对每个靶标团结位点（target binding site）的试剂，例如针对每个靶标团结域的靶标和/或anti-idiotypic抗体的组合，来测定完整的双特异性分子是否最有价值。

Anti-idiotypic 抗体

   当一种抗体与另一种抗体的idiotope结适时，它被称为抗idiotope抗体�？固宓目杀洳糠�，包括奇异的抗原团结位点，被称为idiotope。Idiotopes内的表位组合关于每种抗体都是唯一无二的(图2).由于现在开发的大大都单克隆抗体药物是人源的某人源化的，因此最可能诱导抗药物抗体（ADA）的免疫原性表位（immunogenic epitopes），保存于提供大大都团结接触面（binding contacts）的hypervariable complementarity determining regions（CDR）之内�？梢蕴焐筰diotypic抗体，特异性地团结一个单克隆抗体药物。这些高度特异性的抗体可用于，以差别测试名堂，开发药代动力学（PK）定量要领，以测定临床前和临床样本中的游离药或总药物的浓度，或在ADA测试中作为阳性比照等。

图2. 抗体idiotope：抗体可变区域的，奇异的抗原决议因素（antigenic determinants）的荟萃。

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    在这方面，药物的MOA在选择合适的剖析要领时很主要，特殊是在药物活性依赖于双特异性药物对两个靶点的同时作用的情形下�？笴D3/抗肿瘤靶标双特异性药物就是一个例子：测定完整的，有活性的双特异性分子是充分表征该药物的最佳战略。反之，若是药物活性依赖于一个靶点的加入，而另一个靶点的加入只是增强了药物活性, 那么，测定完整药物可能就不那么主要了；此时，只使用一种药物特异性试剂 (例如，单臂靶向/1-arm target，单臂/1-arm延伸 PK或增添袒露量) 可能是合理的战略。另一种要领的一个例子是评估catumaxomab抗体的PK: 该PK剖析要领使用了该抗体药物是小鼠/大鼠的嵌合结构体，使用了特异性的antispecies immunoglobulin的捕获/检测试剂。这里，使用了一个针对药物的嵌合结构的混淆通用剖析名堂（mixed generic assay format）；该要领特异性来自嵌合结构，而不涉及CDRs。这种要领基于两个假设: 首先，单克隆抗体(mAb)药物在体内通常很是稳固。其次，靶标卵白没有可检测到的可溶性形式。因此，该PK剖析要领可以测定血液循环中游离的catumaxomab单抗，这是切合其预期用途的。一样平常来说，默认的生物剖析战略是使用双特异性药物的双特异性，但需要熟悉到开发这样的试剂是耗时的和有挑战的；并且可能在药物发明甚至非临床研究阶段还没有这样的试剂。下面将更详细地考量种种选择。

PK定量要领的设计

完整双特异性分子的剖析要领

 
    完整双特异性分子定量的目的是测定生物基质中完整的双特异性分子。该测试只测定有活性双特异性分子，其没有任何功效区域被抗药物抗体(ADA)或血液循环中的靶点切断（clipped off）或阻断（blocked）。完整分子的检测要领通常需要使用靶标抗体和/或anti-idiotypic抗体，以测定包括可团结捕获和检测试剂这两个功效域的分子。在评估体内或体外稳固性时(假设试剂可用)，建议接纳完整分子的剖析要领。完整分子定量的测试名堂如图3A所示。

 
     这种测试名堂使用两个靶标分子或两个完全中和性的anti-idiotypic抗体，或两者的组合。最近， LC-MS，团结affinity pull-down（使用靶标或anti-idiotypic抗体）以疏散待测物，已用于表征的生物基质中的药物完整分子。Affinity pull-down是一种类似于免疫沉淀（immunoprecipitation）的小规模亲和纯化手艺，只是抗体也可以被其它亲和系统所取代。

 
     这是一种sequential要领：首先，使用anti-idotypic抗体来下拉（pull down）双特异性药物的游离形式；然后，用LC-MS法举行定量。使用这种形式，可以确定双特异性分子的游离浓度。然而，在要领开发历程中需要思量几个要害因素:

 
     该测试名堂必需设计好，以阻止潜在的空间位阻效应（steric hindrance）。一些双特异性分子被设计为靶向一个可溶性分子和一个与细胞团结的分子(细胞外貌受体)。这种双特异性分子被明确设计为与两个靶点同时相互作用，以施展其预期的药理活性。然而，双特异性分子和检测试剂在检测情形中可能有差别的相互作用，换句话说，在塑料容器外貌可能体现出差别的相互作用。因此，应该明确和审慎的处置惩罚空间位阻效应。例如，从位阻效应研究中网络的数据，例如，在Octet平台上考察域团结滋扰（domain binding interferences）的数据，可能指向选择一个特定的捕获和检测顺序，以阻止不须要的空间位阻效应;


     一些双特异性分子，通过协同作用，具有很高的药效学效力（highly pharmacologically potent），这可能意味着只需要很是低的临床剂量。因此, 基于已知的剂量-响应数据和剂量模子（dose modelling）的剖析要领迅速度将会是一个主要的考量指标;


     与古板的单特异性抗体相比，双特异性分子更有可能泛起体内生物转化（biotransformation），即体内不稳固性（in vivo instability）。生物转化不但可能影响双特异性分子的活性，并且还可能影响定量双特异性分子的可靠性。因此，完全中和性，anti-idiotypic抗体或靶标分子(图3A)有可能允许检测潜在的生物转化（consequential biotransformation）;

    图3. 用于定量双特异性分子的差别测试名堂和试剂。(A)完整分子的测定要领：使用靶标卵白X和靶标卵白Y作为检测试剂，测定完整双特异性分子的浓度。(B) 功效域剖析：接纳抗Fc抗体和靶标Y卵白作为检测试剂来丈量功效域Y的浓度。(C)功效域剖析：接纳抗Fc抗体和X靶标卵白作为检测试剂来丈量功效域X的浓度。(D)总浓度测定要领：通过使用两种抗Fc抗体作为测试试剂来测定双特异性分子的所有可溶形式。

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    与单特异性生物药分子类似，如通例的单克隆抗体，ADA可以通过阻断捕获或检测试剂与药物的团结来滋扰对双特异性分子的定量(注重不要与改变的药物扫除率相混淆)。别的，一个结构域可能是immunodominant；那么取决于测试名堂，这可能会导致PK剖析效果的差别。另外，也许除了内源性的IgG4分子之外，双特异性分子所固有的新颖，非自然结构，可能使双特异性分子比单特异性分子更容易诱发ADA反应，这是免疫原性危害评估的一个思量因素。


功效域剖析（functional domain assay）


     功效域剖析是测定一个功效域的浓度，此名堂可用于展示相关的简单功效域的浓度。当双特异性的MOA使得药物分子的一部分（a partial molecule）保存部分活性时(如可溶性靶标，融合卵白，或肽激动剂)，这些检测显得尤为主要。功效域剖析的目的是确定哪个功效域是有活性的，因此，可用于诠释与ADA的形成或生物转化相关的功效损失。


     单域测试名堂的设计如图3B和3C所示。该要领特意使用药物靶标，或抑制性anti-idiotypic抗体来剖析双特异性分子的游离结构域（free domain）， 并与抗Fc或抗框架（anti-framework）抗体，作为捕获或检测试剂，联用。这些剖析要领可用于药物开发的任何阶段。有时，基于细胞的测试要领可以用于丈量单个功效域，如blinatumomab情形。


     图3. 用于定量双特异性分子的差别测试名堂和试剂。(A)完整分子的测定要领：使用靶标卵白X和靶标卵白Y作为检测试剂，测定完整双特异性分子的浓度。(B) 功效域剖析：接纳抗Fc抗体和靶标Y卵白作为检测试剂来丈量功效域Y的浓度。(C)功效域剖析：接纳抗Fc抗体和X靶标卵白作为检测试剂来丈量功效域X的浓度。(D)总浓度测定要领：通过使用两种抗Fc抗体作为测试试剂来测定双特异性分子的所有可溶形式。

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总浓度剖析要领（total assay）

 
     总体测定法（total assay）用于测定双特异性分子的所有可溶形式。这种测试名堂可用于显示双特异性分子的保存，而不思量任何结构或功效的转变。该剖析要领通常用于测定卵白质的主（骨）干（backbone）结构，如Fc结构域。但这可能并不适用于所有的结构；取决于结构的性子，也纷歧定适用于所有的分子变构体，例如，在临床研究中rhuMab双特异性药物。总体测定法应当耐受ADA和与靶标的团结（target binding）。图3D形貌了总体测定法，其中两个与差别表位团结的抗人Fc抗体可以用作捕获和检测试剂。


 
    图3. 用于定量双特异性分子的差别测试名堂和试剂。(A)完整分子的测定要领：使用靶标卵白X和靶标卵白Y作为检测试剂，测定完整双特异性分子的浓度。(B) 功效域剖析：接纳抗Fc抗体和靶标Y卵白作为检测试剂来丈量功效域Y的浓度。(C)功效域剖析：接纳抗Fc抗体和X靶标卵白作为检测试剂来丈量功效域X的浓度。(D)总浓度测定要领：通过使用两种抗Fc抗体作为测试试剂来测定双特异性分子的所有可溶形式。

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    同样，简单多克隆抗人IgG试剂也可用作捕获和检测试剂。但此要领只用于非临床研究。关于丈量总体药物浓度， LC-MS很是有用，特殊是当没有特定的试剂可用时。总体测定法可与“完整intact”或“有用active”药物测定法，团结使用，或同时使用两者，以评估体内外（in vivo /ex vivo）的稳固性，以及生物转化（biotransformation）对结构-功效关系的影响，例如，某些deamidation或氧化反应可能破损药物与靶标的团结。

 
   PK样本中生物情形的重大性为使用哪一种定量要领增添了另一层挑战。生物剖析要领的应用是从药物发明和临床前清静性评估时代的动物研究最先的，一连光临床开发，并延伸到上市后的生命周期管理(即附加顺应症和/或组合疗法)。正如前面所指出的，差别的剖析战略可以在差别的开发阶段使用；当体内结构-功效关系确立之后，可以在药物发明和开发的整个历程中开发和使用简单的定量剖析要领。可是，需要对剖析要领的生命周期管理有特殊思量，以便未来自多个物种和差别目的患者群体的PK/PD知识整合到所探索顺应症中去。

双特异性分子的要领验证和认证（method validation & qualification）


    对双特异性分子的要领验证和认证与其他大分子一样，包括细密度和准确度，稀释线性度，选择性，滋扰和特异性，以及稳固性测试，以确保数据的稳健性和完整性。然而，由于双特异性分子的性子，如上所述，在开发完整分子的剖析要领时，对这两个结构域的特异性和剖析滋扰的评估都是须要的。

特殊声明

    本文若有疏漏和误读相关指南和数据的地方，请读者谈论和指正。所有引用的原始信息和资料均来自已经揭晓学术期刊, 官方网络报道, 等果真渠道, 不涉及任何保密信息。参考文献的选择思量到多样化但也不可能完整�；队琳咛峁┯屑壑档奈南准捌淦拦�。

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